非酒精性脂肪性肝炎诊断研究进展

欢迎参加2020中国NASH大会！

药时代编者按：2020年6月12日是第3个国际非酒精性脂肪性肝炎日(International Nonalcoholic Steatohepatitis Day)，这一活动是由全球肝脏倡议组织(Global Liver Initiative)非酒精性脂肪性肝炎教育计划(NASH Education Program)于2018年6月发起的一项全球性公共教育活动。旨在提高普通百姓、脂肪肝患者及高危人群、医学界、公共卫生部门和广大媒体等对非酒精性脂肪性肝病及其严重类型非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的认识，推动脂肪肝防治研究的进展，从而阻止这类由于体重超重、腹型肥胖、2型糖尿病、代谢综合征导致的代谢相关脂肪性肝病的流行，改善广大脂肪肝患者的生活质量，显著降低脂肪肝的疾病负担。

《药学进展》编者按：非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是影响全球上亿人的一个重要健康问题，迄今为止尚无任何FDA批准的特效药物。令人振奋的是，2019年见证了NASH新药发现和开发方面的进步，FDA有望在2020年批准首个NASH新药。《药学进展》与中国NASH新药联盟、药时代携手合作，开辟NASH专栏，旨在汇聚行业专家智慧，报道NASH最新研究进展，探讨高效开发新药的战略战术，提升中国NASH新药研发的整体水平，以推动和加快NASH新药的研发上市，惠及中国及全球患者。

专家介绍：郑松柏

医学博士，广州华银医学研究所首席技术官，华银集团实验室管理中心总监、中国合格评定国家认可委员会（CNAS）医学实验室评审员，中国医药生物技术协会组织生物样本库分会中医药学组委。曾多次参与CNAS组织的 ISO15189、17025、15195、CAP实验室认可工作，负责或参与过多个乙肝、丙肝、糖尿病、肿瘤等中心实验室项目，参编人民卫生出版社专著6部、获得各级医疗科技成果奖励7项、发表论文32篇、主持和参与国家科技支撑计划等各级课题16项，开发过多个丙肝分型方法以及丙肝多个型别 NS3/4A、NS5A、NS5B耐药检测方法，曾负责过乙肝、丙肝、糖尿病、实体肿瘤、血液肿瘤及其他疾病伴随诊断项目的技术开发、管理工作。

正文

非酒精性脂肪性肝炎诊断研究进展

龙健灵 1，徐蕙 1，曾梦 1，杨磊 2，郑松柏 1* 

（1. 广州华银医学研究所有限公司，广东 广州 510700；2. 南方医科大学基础医学院病理学系，广东 广州 510515） 

[摘要]非酒精性脂肪性肝病是一种慢性非传染性疾病。近年来其患病率和发病率不断增高，发病年龄也出现低年龄化趋势，该疾病已取代慢性乙型肝炎成为第一大慢性肝脏疾病。重点综述非酒精性脂肪性肝病中的非酒精性脂肪性肝炎的诊断研究进展，介绍非酒精性脂肪性肝炎的临床病史、病理学诊断、非侵入方法诊断，为临床诊断提供参考。

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种慢性、非传染性流行病。全球NAFLD的流行率约为25%。在亚洲，从城市到农村地区的患病率从高到低呈梯度变化。近年来NAFLD患病率、发病率不断增高，发病年龄也出现低年龄化趋势，目前NAFLD已经取代了慢性乙型肝炎，成为第一大慢性肝脏疾病。此外，NAFLD在儿童中的流行率也很高，约为10%。
NAFLD两种常见的临床表现为非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL，又称单纯性脂肪肝）和非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）。NAFL往往是良性非进展性疾病，而NASH可进展为肝硬化，在极少数情况下可导致肝细胞癌（HCC）。
NASH的诊断应排除：①过量饮酒史（男性>210g·d^-1，女性>140g·d^-1）；②药物导致的肝脏损伤；③其他肝脏疾病。目前，肝脏活检依然是公认的NASH诊断金标准。近年来随着医学技术的发展，影像学及生物标志物越来越多地被应用于NASH的诊断，本文从临床病史、病理学诊断、非侵入方法诊断等方面，对NASH的综合诊断研究进展进行综述。
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临床病史

对肥胖、糖尿病或多发性硬化症患者，应进行NAFLD的筛查。大部分NAFL或轻度NASH患者无明显症状，有时会出现轻微的上腹压迫感及易疲劳。大多数情况下，患者在常规体检中，常常由于血生化检测显示肝酶升高或超声检测显示肝脏脂肪变性，而疑似NAFLD。因此对于肥胖、高尿酸、2型糖尿病患者以及三高（高血压、高血脂、高胆固醇）人群应重视NAFLD的筛查。此外，由药物、毒素、脂肪代谢障碍、自身免疫和严重炎症疾病等因素引起的肝脏脂肪变性，在NAFLD的确诊中，应进行充分评估。
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病理诊断

肝脏活检仍然是诊断NASH的金标准，也是目前唯一能可靠区分NAFL和NASH的方法；此外还是评估NASH患者肝脏疾病进展或消退的有价值的检测方法。NASH与酒精性肝病相似，随病程的进展而表现不同，包括肝细胞的脂肪变性、坏死、炎性细胞浸润和Mallory-Denk小体形成，甚至有纤维化和假小叶形成。目前普遍将脂肪变性作为NASH最基本的病理学表现。
为了更好地评估NASH的疾病发展过程，为临床提供可量化的病理组织学评估，以及对治疗效果进行科学评价，近年来，病理学者致力于建立一套科学的组织学评估系统。NASH临床研究网络病理委员会（the Pathology Committee of NASH Clinical Research Network，NASH-CRN）提出，NASH是指在没有大量饮酒的情况下，通过肝脏活检发现存在脂肪变性、炎症和肝细胞气球样变化，并且制定NAFLD活动评分（NAS）的分级系统，该系统由14项组织学指标构成，其中4项进行半定量计分，包括：脂肪变性（0~3）、小叶内炎症（0~3）、肝细胞气球样变（0~2）、纤维化（0~4），另外9项以“有”或“无”表示（见表1）。NAS对各项组织学指标并无偏重，区分组织学改变的目的是为了评估整个NAFLD活动度，而不是评估NASH严重程度和进行NASH诊断，但NAS不能作为NASH进展程度的评判尺度，它主要用于临床NASH治疗后组织学改变的评估。学术界对NASH的组织学特征及NAS仍存在较大的争议，不同的病理学家对NASH的定义也不尽相同，对于病理工作者而言，准确地诊断NASH仍存在一定的难度。在此基础上，美国肝脏疾病研究协会（Association forthe Study of Liver Diseases，AASLD）提出了一个对于临床应用更加实用的标准，即脂肪变性>5%、不同程度的肝细胞气球样变、不同程度的小叶炎症，该标准更加精确地提出了3种指标的最低标准，得到更多肝病学家及病理学家的认可，也为多中心流行病学研究和临床试验提供了理论基础。


由于纤维化被认为是NASH进展阶段的一个标志，学术界近期提出一种改进的评分系统，称为SAF评分，即：脂肪变性（steatosis，S，0~3）；活动等级（activity，A，0~4）是气球样变（0~2）和小叶炎症（0~2）的未加权相加；纤维化（fibrosis，F，0~4）[11]。相比于NASH-CRN提出的评分系统，SAF评分在脂肪变性和气球样变上增加了对肝细胞大小及形状的描述。以含有大中型胞质内脂滴的肝细胞百分比评估脂肪变性（S0：<5%；S1：5%~33%；S2：34%~66%；S3：>67%）。肝细胞气球样变程度分为0级（0级：正常肝细胞，呈长方体形状，棱角分明，胞质呈粉红色，嗜酸性）、1级（存在肝细胞簇，呈圆形，胞质苍白，常呈网状，形状虽不同，但大小与正常肝细胞相似）和2级（与1级气球样变肝细胞簇内的正常细胞相比，至少为2倍大小）。小叶炎症定义为小叶内有2个或2个以上的炎性细胞的病灶，在低倍镜下计数，分为0级（无病灶）、1级（每个小叶<2个病灶）和2级（每小叶>2个病灶）。基于SAF评分，研究者提出了一种算法——脂肪肝进展抑制（fatty liver inhibition of progression，FLIP）算法，用于区分在存在脂肪病变（即S≥1）的情况下的NASH和非 NASH。FLIP算法根据SAF的3个基本特征（脂肪变性、气球样变、小叶炎症）评价得分对NASH进行分类区分，对于至少有5%的脂肪病变（即S≥1）的病例，该算法列举了9种可能情况进行诊断区别（见图1）。此外，根据活动等级（A）和纤维化程度（F）来定义整体组织学严重程度，分成与NASH轻度疾病（A<2和F<2）和严重疾病（A>2和/或F>2）。研究表明，基于SAF评分的FLIP算法可以减少病理学家、观察者之间的评定差异，更适用于临床诊断应用。

然而，任何的评分系统都不能完全代替肝脏活检的分析描述，进行肝脏活检时，获取高质量的组织标本是非常重要的。活检标本的长度为10~30mm，直径为1.2~2mm，占肝脏总质量的1/50000，因此存在取样误差的重大风险。标本长度不够或碎片化、取样错误和观察者之间的差异等因素，将影响对肝脏损伤程度的正确评估。病理学家的经验程度也可能影响观察者之间的一致性。即使是专业的肝脏病理学家，NAS评分也可能会有1~2个点的差异，而且纤维化评分可能会有1个点的差异。Gunn等认为，不是所有疑似患有NAFLD的患者，都要进行肝活检。只有当肝活检可以改变患者的治疗建议，使患者意识到自己有严重的肝脏疾病，或者在临床数据不一致的患者中确认或排除NAFLD时，才应进行肝脏活检。疑似患者的肝转氨酶、肝超声、其他原因引起肝病的血清学检测数据，以及患者是否有代谢综合征或超重等因素，应作为判断是否进行肝脏活检的依据。另外，大约30%的肝脏活检病例伴有短暂的疼痛、焦虑和不适，甚至可能危及生命的并发症（0.3%的病例出血，0.01%的病死率）。


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非侵入方法诊断

随着医学技术的不断发展，一些无创的方式越来越多被应用于诊断与预测NASH 及阶段性肝纤维化。这些方法包括预测模型[增强型肝纤维化（ELF）评分]和血清生物标志物检测。瞬时弹性成像（FibroScan，TE）或磁共振弹性成像（MRE）技术被用于评估肝硬度，可作为潜在肝纤维化的评估技术。总之，开发准确、安全和易于使用的非侵入性方法，以准确诊断和监测NASH和相关的纤维化，在临床实践和临床研究中具有极其重要的意义。这些检测不仅对于进展性肝病的最大风险分层很重要，而且可以作为NASH治疗性临床试验的适当替代终点。
3.1常规实验室诊断
NAFLD的实验室诊断中，最常见的异常参数为血清谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT），在排除其他原因的肝脏损伤后，可作为NAFLD的支持诊断。当AST与ALT比值<1可作为NASH的支持诊断。但部分NAFL患者甚至NASH患者的血清转氨酶处于正常水平，因此该参数不够敏感。与其他肝脏疾病相同，NAFLD患者血清谷氨酰转肽酶（GGT）和胆碱酯酶、血清铁蛋白水平也升高。在区分NAFLD与其他肝脏疾病中，常规实验室的性能参数的敏感性及特异性没有达到令人满意的水平。然而，临床和实验室参数被纳入预测模型时可以提高诊断准确性。
各种评分系统也被逐步用于评估与预测NASH，这些系统都是基于各种临床表现和现成的生化检测，包括BARD评分（包括BMI、AST与ALT比值、是否有糖尿病）、NAFLD纤维化评分（包括年龄、BMI、是否有胰岛素抵抗或糖尿病、 AST、ALT和血清白蛋白），以及FIB-4（包括年龄、AST、ALT和血小板计数）。
3.2影像学诊断超声检查是脂肪肝变性诊断的一线检测工具，然而超声波检测微小脂肪变性能力很差，因此超声检测无法区分单纯性脂肪变性、NASH以及肝硬化。计算机断层扫描（CT）只能评估中度脂肪变性，不能检测早期肝硬化或肝纤维化的程度。此外，还有辐射暴露的缺点。因此，CT不作为诊断NAFLD的常规项目。
磁共振成像（MRI）在检测微小脂肪变性和脂肪量化方面，优于超声检测和CT检测。Leporq等通过同时定量NAFLD患者的肝脏脂肪含量、脂肪酸组成、T2*横向松弛时间和磁化率，建立了脂肪性肝炎的诊断的磁共振定量检测方案。该研究对32例经活检证实的非脂肪肝性疾病患者进行验证，其中12例患有单纯性脂肪变性，20例患有NASH。32例患者中，单纯性脂肪变性和NASH患者的肝脏脂肪组分和T2*横向松弛时间和磁化率无明显变化。相比之下，NASH患者的饱和脂肪酸含量比单纯性脂肪变性患者高（48.2%vs44.4%，P<0.05），磁化率下降（P<0.001），特征曲线下面积为0.91（95%CI为0.79~1.0）。该研究表明，对肝脏脂肪含量、脂肪酸组成、T2*横向松弛时间和磁化率同时进行磁共振定量的检测方案对NASH的诊断具有较高的诊断价值。
TE是近年来应用较广的一种非侵入性检测方法，用于评估肝脏纤维化程度以及肝脏硬度。Boursier等报道了TE评估的肝纤维化的阴性预测值（NPV）为90%，敏感性为88%，阳性预测值（PPV）为65%，与血液检测相比，更少的患者（43.6%）处于“灰色区域”。
3.3基于生物标志物的诊断NASH的诊断依赖于肝活检，同时也受到病理学家的观察者间差异的限制。越来越多的研究者关注无创诊断，是否能找到适合的生物标志物成为NASH诊断的一个关键。
NASH中肝脏损伤的发病机制复杂，涉及多种激素、细胞和分子的干扰。这一复杂性导致了许多潜在的NASH生物标志物的产生，这些标志物反映了潜在的疾病途径，包括肝细胞凋亡、炎症、氧化应激和异常的脂肪信号。血清转氨酶水平目前仍然是评估慢性肝病最常用的血液参数，然而，研究表明单独的ALT水平不能很好地预测NASH。
与单纯的脂肪变性相比，NASH使肝细胞凋亡或坏死增加，并导致细胞角蛋白 18（CK18）水平上调。然而，基于CK18的诊断方法敏感性和特异性分别为66% 和82%，在临床应用中仍不够准确，为增加诊断价值，研究人员将CK18与血清凋亡介导表面抗原FAS（sFAS）水平联合使用作为检测指标，其中sFAS参与激活肝细胞内的外源性凋亡通路。一项研究表明，CK18的M30片段（CK18-M30）和sFAS水平的结合使用具有合理到极好的准确性（曲线下面积为0.79~0.93），但其临床应用还亟待进一步的验证研究。
炎症是NASH的组织学特征之一，因此血清中C-反应蛋白（CRP）、IL-1受体拮抗剂蛋白（IL-1RA）、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子（TNF）以及 CXC- 趋化因子10（CXCL10）等多种炎症标志物和介质水平被作为诊断标志物的研究对象。在一项648例经活检证实的NAFLD患者参加的研究中，对32个血浆生物标志物进行检测后，发现 IL-8、可溶性 IL1R1、总纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI1）和激活的 PAI1（aPAI1）的水平与 NASH 相关。然而，在排除临床和代谢因素后，只有aPAI1仍然可以预测NASH。aPAI1作为纤维蛋白溶解抑制剂，通过调控凝血功能从而增加心血管风险，但该指标不太可能是作为一项唯一标志物，还需通过进一步的研究与其他标志物联合诊断。
氧化应激是NASH中肝脏损伤的主要致病机制之一，可对其导致的脂质氧化和血清产物进行检测。Feldstein等利用质谱法研究发现脂质氧化产物[11-羟基二十碳四烯酸（11-HETE）、羟基十八碳二烯酸（HODE）、氧化十八碳二烯酸（oxo-ODE）]与 NASH 相关，由 13-HODE 比值 + 年龄、BMI 和AST 构成 oxNASH 评分，该评分目前已被证实对NASH 具有合理的诊断准确性。然而，对特殊设备的需求和标本处理的成本目前限制了脂质氧化产物作为NASH诊断工具的广泛应用。
脂肪因子[包括脂联素、瘦素、抵抗素、内脂素（NAMPT）、视黄醇结合蛋白4（RBP4）、脂肪酸结合蛋白4（FABP4））]和肝源性激素[如成纤维细胞生长因子 21（FGF21）]参与 NAFLD 的发病过程，并与 NAFLD 的严重程度密切相关，但不是 NASH 的特异性血清标志物。2017年发表的一项研究分析表明血清FGF21水平与NASH之间存在一定的关联，然而，该生物标志物的敏感性和特异性仅分别为62% 和78%。铁蛋白作为一种急性期反应物，在NAFLD和代谢综合征患者中常呈现为水平上调。有研究表明高铁蛋白血症与NAFLD患者的晚期纤维化之间存在相关性。
肝纤维化是数百万肝病患者的常见病，但由于其分子机制的不明确，目前尚无有效的治疗方法。南方医科大学病理系周伟杰教授团队最新研究揭示了白细胞衍生趋化因子-免疫球蛋白样表皮生长因子同源性家族受体酪氨酸激酶1（LECT2-Tie1）信号通路通过调控肝脏门脉血管新生和肝血窦毛细血管化进而调控肝纤维化进程的新机制，并提出了应区别对待门脉血管新生和肝血窦毛细血管化在肝纤维化进展中的不同作用的新观点，提出靶向 LECT2/Tie1 信号通路可能是肝纤维化的潜在治疗靶点，血清 LECT2 水平可能是筛选和诊断肝纤维化的潜在生物标志物。
CK18是NASH诊断中应用最广泛的血清学检测指标，但CK18的诊断准确性仅为中等水平，尽管其他生物标志物或组合诊断有望成为诊断指标，但大多数尚未得到验证。不同的NASH生物标志物在临床试验中的应用取决于研究药物的作用机制。例如，用于评估代谢变化、凋亡或细胞死亡、炎症或纤维形成的生物标志物可能与靶向肝细胞凋亡的药物更为相关。

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结语与展望

在过去的几十年里，我们对NAFLD的认知，已经从一个无法识别的实体演变成一个具有共同表现型肝脂肪变性的异质性重叠肝脏疾病的集合体。NAFLD相当普遍，影响了全世界大约25%的成年人群体，其中的NASH患者，特别是伴有严重纤维化的患者，在不良临床结果、死亡率以及重大经济负担方面面临着较高风险。庆幸的是，全球医学研究机构和产业界慢慢认识到该疾病的危害性，已在该领域投入大量人力和资金，相信在若干年以后，将有更加简单而精准的诊断手段及良好治疗药物面世，为患者带来福音。
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